CRISPR核酸检测技术

      从原核生物的适应性免疫机制衍生出的CRISPR-Cas系统，以其特异性高、可开发性强、简单高效等特点迅速从众多具有竞争力的基因编辑技术中脱颖而出，既为体内基因编辑技术带来革命性突破，也在体外诊断领域开拓了新的方向。近年来涌现出许多快速、便携、经济、高效的基于CRISPR-Cas系统的体外诊断技术，这些技术在病原体检测方面展示出良好的性能，在肿瘤基因诊断、遗传病筛查、移植排斥反应检测，癌症检测，微生物耐药性检测，环境微生物检测等领域也具有很大潜力。

     最早的crispr核酸检测技术是利用氨基酸修饰的dcas9蛋白与egfp荧光蛋白融合，在特定的向导rna引导下，特异性与靶标序列结合。该方法耗时长，成本高，操作复杂，实际应用比较困难。

     crispr核酸检测技术的转折点在2016年，张峰团队发现cas13a具有旁路切割活性。当cas13a与带有靶标识别区域的crrna结合后，能够特异性识别靶标单链rna，并对靶标rna进行切割。于此同时，该酶的旁路切割活性被激活，非特异性地剪切附近的单链rna。利用这一技术，2017年，第一种较为简单且实用的crispr核酸检测技术sherlock诞生。同一时期，cas12a的旁路切割活性亦被发现。不同于cas13a，cas12a在向导rna的引导下，能够特异性识别和结合双链dna，并获得对单链dna的旁路切割活性。在此技术的基础上，detectr和holmes检测法相继发表。

1. CRIPR-Cas系统简介
      CRISPR-Cas系统是原核生物的一种特殊的免疫系统，这种免疫系统存在于大约一半的细菌和几乎所有古核生物中，CRISPR-Cas介导的适应性免疫功能可以概括为3个过程：适应、CRISPR RNA（crRNA）的成熟和靶向干扰[1]。根据 Cas 效应蛋白的种类，CRISPR-Cas系统通常可分为2大类，包括6个类型和48个亚型[2]。一类CRISPR-Cas 系统（一类系统）包含3个类型：Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ，其代表分别有Cas3、Cas10和Csf1，它们利用具有多个Cas蛋白组成的CRISPR相关病毒防御复合物（CRISPR associated complex for antivirus defense，Cascade）来形成干扰机制以切割目标核酸序列。大约90%的CRISPR-Cas系统属于一类系统。二类CRISPR-Cas系统（二类系统）也包括3种类型：Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ，其代表分别有Cas9、Cas12a（Cpf1）和Cas13a（C2c2），最近发现类型Ⅴ还包括一种相对分子质量最小的Cas14。

2.CRISPR-Cas9的病原体核酸检测方法

      Pardee等开发了核酸序列性扩增（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）CRISPR裂解（NASBA CRISPR cleavage，NASBACC）检测方法来检测血样中的寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）并利用其鉴别SNP的能力来区分美国和非洲ZIKV株。该方法先利用NASBA技术逆转录RNA并扩增出足够多dsDNA，Cas9特异性结合并切割目标dsDNA，最后利用toehold传感器通过试纸上颜色的改变读出结果。Huang等将CRISPR-Cas9与指数扩增反应（exponential amplification reaction，EXPAR）配对，建立了Cas-EXPAR方法。Cas9在含PAM位点的独立寡核苷酸的帮助下将ssDNA分子切割成短片段（X片段），X片段被核酸内切酶NEase切割，并通过外源DNA聚合酶从EXPAR模板中释放出来，最后，对X片段进行循环扩增，扩增产物用实时PCR（real-time PCR，RT-PCR）进行检测，可快速高敏地检测出李斯特菌DNA。Wang等构建了CRISPR分型PCR技术，通过凝胶电泳或接收荧光信号鉴定PCR产物，可用于检测两种高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）16和18。Quan等建立了杂交发现低丰度序列的二代测序方法，已应用于诊断耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐万古霉素肠球菌感染以及检测恶性疟原虫耐药基因。该方法利用sgRNA-Cas9复合物剪切磷酸酶处理的病原体基因组DNA或互补DNA，再将切割产物连接到通用测序适配器，然后对扩增后产物进行二代测序。Wang等开发了一种CRISPR-Cas9介导的侧向流动分析方法，该检测方法能在1 h内检测出李斯特菌 或非洲猪瘟病毒DNA。

       由Cas9基因改造而来的dCas9具有DNA特异性结合能力，但没有裂解活性。Zhang等将分裂的两半荧光素酶与dCas9融合，设计了一对针对DNA上下游序列的sgRNA，当这两部分荧光素酶相邻时，分裂后的荧光素酶活性将被恢复，该方法称为PC reporter，用于检测结核分枝杆菌。Guk等建立了一种CRISPR介导的DNA荧光原位杂交技术检测MRSA的方法，该法使用SYBR Green I作为荧光探针，用dCas9特异性捕捉靶DNA。另一类经过改造的Cas9蛋白突变型Cas9n，其一个核酸酶活性结构域失活，故只能切割ssDNA。Wang等[16]利用Cas9n建立了基于Cas9n的扩增反应，用于检测鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌等细菌的DNA。

 3.CRISPR-Cas12/Cas13的病原体核酸检测方法

       Chen等利用LbCas12a建立了DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统（endonuclease-targeted CRISPR trans reporter，DETECTR）。利用Cas12a-crRNA复合物结合并剪切与PAM互补的dsDNA和非PAM依赖的ssDNA后激活的附带切割活性，可有效检测出临床样本中的HPV16型和18型。一小时低成本多用途高效系统与DETECTR的原理相似，具有快速、经济、多重、高效的特点，与DETECTR不同的是，它既用于检测DNA病毒，如伪狂犬病病毒；还可以检测RNA病毒，如乙型脑炎病毒。Dai等首次建立了一种基于CRISPR-Cas12a的电化学传感器，该方法利用电化学电流的报告方式检测目标核酸，可检测HPV16型和细小病毒B19的DNA。Teng等开发了一种由Cas12b介导的DNA检测方法，用于检测人血浆中HPV16型DNA。Wang等开发了一种Cas12介导的横向流动分析技术，可快速准确检测非洲猪瘟病毒核酸。

        Cas13a是至今发现的唯一一种以ssRNA为靶点的Cas，Cas13的附带切割活性也针对ssRNA。Gootenberg等等利用LwaCas13a效应蛋白具有良好靶向激活附加切割活性特点，建立了一种特异高灵敏度酶报告系统（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）的检测方法，已用于检测患者尿液或血清样本中的ZIKV和登革病毒。因其单核苷酸切割特异性的优势，故此法也可用于患者的基因分型和肿瘤相关突变的检测。为使检测过程更加简便，将SHERLOCK与一种对未提取的诊断样品进行加热来消除核酸酶（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON）的方法配合，可实现临床样本免核酸提取的检测，该方法特别适合无仪器和实验室条件的现场进行快速核酸检测。改进后的多重检测方法SHERLOCKv2，利用4种不同的Cas13和Cas12酶的进行组合，可在单个反应中检测到4种核酸序列，并且通过使用CRISPR相关酶Csm6来提高Cas13附带切割活性，检测灵敏度提高了约3.5倍。

       微流控技术和基于CRISPR-Cas13的检测方法的有机结合与集成，使得同时进行数百个样品或多个病原体检测成为可能。Qin等开发了一种基于Cas13a的自动化微流控POCT装置，可在不需要扩增的情况下同时检测多达24个样品中的埃博拉病毒RNA。此外，核酸多重评估的组合排列反应Cas13（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids-Cas13，CARMEN-Cas13）将微孔阵列和基于Cas13的检测方法结合在一种多通道的检测方法中，能够一次性同时运行近5 000个测试；除了病毒检测，CARMEN-Cas13还可用于区分甲型流感病毒的所有血凝素（H1－H16）和神经氨酸酶（N1－N9）亚型。Shinoda等结合前期开发的脂质双层微阵列系统的免扩增RNA检测方法建立了一种Cas13介导的RNA检测技术，该技术已用于检测新型冠状病毒。
   

4.CRISPR-Cas系统的病原体核酸检测技术的优缺点

      传统病原体检测方法包括病原微生物的培养、抗原/抗体检测、PCR扩增检测、等温扩增技术、二代测序技术等，这些技术都各具特点，定性或定量PCR、逆转录PCR是目前病原体核酸检测最常见的方法。但经典PCR检测需要特殊仪器并在特定的实验环境下使用，检测成本高、样本运转周期长以及人员和设备要求高等特点限制了其应用。许多等温扩增方法技术虽然降低了硬件设施的要求，部分也降低了检测时长，但为了实现操作简便、快速的要求，其灵敏度和特异性受到了影响。与这些传统方法相比，CRISPR-Cas系统的优势明显：高灵敏度、高特异性、低成本、低时耗、不需要复杂昂贵的设备、不需要高水平专业知识的人员、可进行现场快速检测，而且可通过不同的样本处理、扩增方式配合各具特色的Cas效应蛋白变体和创新的结果读出方式，更加突显其在病原体核酸检测方面的多功能性。